背景:

       支原体（Mycoplasma）是对支原体科、无胆甾原体科和螺原体科的原核微生物总称，是已知可以自由生活的最小生物，没有细胞壁，形状多样可变，直径一般是 0.1~0.3μm，基因组A-T 含量高，对常见的抗生素不敏感，对热敏感。目前已从污水、植物、动物、禽类、昆虫、人、温泉或其他高温环境中发现 200 种左右支原体。
     细胞如果受到支原体污染，细胞生长速度变慢，细胞产生病变或形态改变。连续培养细胞污染的概率大约15~35%，主要来源于 20 多种支原体，包括口腔支原体 （M.orale）、肺炎支原体（M.pneumoniae）、发酵支原体（M.fermentans）、精氨酸支原体（M.arginini）、莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）和猪鼻支原体（M.hyorhinis）。
      人员操作、污染的细胞、原辅料（血清、胰酶、培养基），实验环境污染（生物安全柜、细胞间，培养箱）、实验仪器（水浴锅、液氮罐）、实验耗材（培养皿、方瓶、细胞工厂）都可能是污染源。污染了的细胞一方面对生产带来巨大影响，另外如果细胞产品、蛋白产品、病毒类产品受到支原体污染，最终会给患者带来潜在的健康风险。因此，监管部门要求企业对细胞库，检定用细胞和产品进行支原体检测，从源头上进行控制，尽早发现，确保放行产品不含支原体。对此，全球各国药物监管部门也发布了支原体检测相关指南，检测方法主要包括荧光染色法、培养法、生化检测方法和核酸扩增法。 上述检测方法中，大多操作步骤相对比较烦琐、灵敏性不高、不能区分支原体种类、需要特殊仪器或所需时间较长。而PCR法操作相对比较简单便捷，PCR扩增后通过电泳分析即可确定是否有支原体污染，并可根据扩增片段的大小大致预测至少11种所污染的支原体种属，也可以对PCR产物进一步测序以确定具体的支原体种属。

概述:

       Rhinogen^® Myco-Acid ^TM PCR支原体检测试剂盒是一种通过巢式PCR法（Nested PCR）检测培养细胞等生物材料中是否存在支原体污染的检测试剂盒。本支原体检测试剂盒是利用两对引物通过巢式PCR法特异性扩增支原体基因组DNA片段，从而实现对支原体的高灵敏度特异性检测的。

图1. Rhinogen^® Myco-Acid^TM PCR支原体检测试剂盒的检测原理图

      本试剂盒提供了PCR Mix（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Loading Buffer），扩增完毕后可以直接上样电泳，可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。配套的阳性对照，便于确定PCR检测是否能正常工作及样品中是否存在抑制PCR反应的物质。原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区（space region）在各种生物种间的碱基序列差别很大，如16S和23S之间的间隔区。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种属间既有非常保守的部分，也有较大差异的部分。在编码16S和23S的保守区DNA上设计一对F1/R1引物，用于扩增16S和23S之间的间隔区，这就是巢式PCR的第一轮PCR（1st PCR），用于初步鉴定是否有支原体污染；然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条F2引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条R2引物进行巢式PCR的第二轮PCR（2nd PCR）。通过巢式PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度。

应用: 

      本试剂盒确定可以扩增的支原体种类及1st PCR和2nd PCR扩增产物长度参考如下表：

试剂包装: 

       Rhinogen^® Myco-Acid^TM PCR支原体检测试剂盒包装规格如下：

      1. 操作简单：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配制操作简便；
       2. 快速检出：通过PCR扩增及电泳分析进行支原体检出只需4-5小时左右；
       3. 灵敏度高：PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列超过1000万倍；
       4. 特异性高：使用巢式PCR反应，提高了检测特异性。

保藏条件:

       采用冰袋运输，收到产品后请立即置于-20℃及以下条件下储存。避免多次反复冻融。